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拉里·戴雷先生（本·斯蒂勒）一直觉得自己是个做大事的人，他一直梦想着自己有一天能做个大冒险家，成就一番事业，成了老婆儿子心目中的大英雄。当然，这一切只是梦想，现在摆在眼前的是他必须在圣诞节之前找到份工作，他和妻子离婚了，如果他没工作，儿子将被判归已另结新欢的妻子抚养。拉里不愿让儿子失望，于是在努力之下终于找到了一份工作，也是惟一一份，纽约自然历史博物馆的守夜人。
夜深人静，第一次当守夜人的拉里先生手持特大号手电筒到自然历史博物馆就职。博物馆的老守夜人告诉拉里说他的任务就是“确保在晚上没有任何东西能进来博物馆，同样也要确保没有任何东西走出博物馆”。拉里觉得这个守夜人是老糊涂了，整个博物馆除了他一人之外，还有什么活物能跑出去呢？从恐龙骨架到西部牛仔的拓荒史模型再到埃及金字塔，这些历史悠久的东西摆放在整个巨大的博物馆里，拉里觉得一个人晚上还逗留在这种地方，多少还是有点心里发毛。
然而，更让他惊魂的在后头。过了半夜，拉里突然听见博物馆走廊有声响，他回头一看，一个硕大的恐龙骨架竟然活了过来正咆哮着朝他蹦过来。躲过一劫的拉里发现除了恐龙之外，博物馆其他的东西全都复活了：画像中的猴子跑出来闲逛，三寸高的西部牛仔们绑架了拉里，把他放在模型铁轨上让火车轧，印第安勇士朝拉里投长矛。惊魂不定的拉里来不及思考为什么这些东西会动起来，他现在惟一的目的就是要让这些东西全恢复原状，否则他第二天肯定会被辞退。在他绞尽脑汁想办法的时候，伟大的救星：美国史上最聪明的总统泰迪·罗斯福
先生（罗宾·威廉姆斯），陈列在博物馆的总统骑马雕像突然也复活了。在罗斯福总统指引下，拉里开始了自己梦想已久但首次遇到的冒险之旅，惊险之余笑料百出，究竟拉里能否让发狂的博物馆居民安定下来，他能否保住这份来自不易的工作？
